تحضير خلايا الكبد:

استخدمت جرذان مؤنثة أو مذكرة من أعمار تتراوح بين 60 - 70 يوما كمصدر للحصول على الكبد. وقد تم تحضير خلايا الكبد بتعديل بسيط على طريقة استخدام الأنزيم الذي يكسر الكولاجين في الكبد المفعم كما أورد بيري وفرند (18) وسيجلين (8) . والأجهزة التي استخدمت في إفعام الكبد مشابهة لتلك التي وصفها ويجل وانجبريتسين.

وقد تم إفعام الكبد مبدئيا عن طريق الوريد الكبدي البوابي بمحلول هانكس المضاف إليه ما يلي: مادة هيبيز (Hepens) بتركيز جزيئي يعادل 25، 0، زلال مصل الأبقار بتركيز 5. 1% وسكر الجلوكوز بنسبة ا،.%. وكان محلول الإفعام يغذى بالأكسوجين بشكل مستمر في جو يحتوي على 95% أكسجين و 5% ثاني أكسيد الكربون. أما حامضية المحلول فقد تم ضبطها على 4, 7 باستخدام بيكربونات الصوديوم بتركيز جزيئي يعادل ه،. وبعد نقل الكبد إلى خزانة مخصصة وفي درجة حرارة معينة تم تغيير المحلول المستخدم بمحلول آخر يحتوي على الأنزيم الذي يكسر الكولاجين بتركيز يعادل 4، 0% وذلك مادة محبطة لأنزيم التريبسين بتركيز يعادل 8 .. ،%، واستمر إفعام الكبد بهذا المحلول لمدة 15 دقيقة حتى بدأ الكبد يتفتت. وبعدها تم جمع الخلايا ورشحت من خلال قماش نيلون للتخلص من الأنسجة الرابطة أو الأغشية. وبعدها تم تمخيض الخلايا على سرعة 55 تسارع لمدة دقيقتين ومن ثم أعيد خلط الخلايا المترسبة في كمية جديدة من محلول هانكس على درجة حرارة 4 م وغسلت الخلايا مرة أخرى في محلول هانكس ومرة أخيرة في محلول سويم (Swims) المضاف إليه ما يلي: 10% مصل العجل ومادة هيبز بتركيز جزيئي يعادل 25.، وبنسلين بتركيز 100 وحدة لكل مليمتر وسكر جلوكوز بتركيز جزيئي يعادل 007، وترايسين بتركيز جزيئي يعادله 50 0، وبعد هذا كله خلطت الخلايا في محلول سويم بتركيز مليوني خلية لكل ملليمتر.

ولمنع التلوث بالجراثيم فقد تم تعقيم جميع الزجاجيات والأدوات المستخدمة في جهاز تعقيم بخاري على درجة حرارة 110 م لمدة 25 دقيقة. أما المحاليل المستخدمة ومحلول الأنزيم الذي يكسر الكولاجين فقد تم تعقيمها بطريقة الترشيح خلال أغشية ذات ثقوب دقيقة (25،. ميكروميتر) .

أما نسبة سلامة الخلايا فقد تم تقديرها بطريقتين:

أ) استثناء صبغة، ترايبان (Trypan) الزرقاء.

ب) النسبة المئوية لتسرب أنزيم مختزل اللاكتيت (Lactate dehydrogenase) إلى الوسط المزروع (20، 21) .

شروط حضانة الخلايا:

لأغراض دراسة أنزيمات الليسوزومات استخدمت صحون لزراعة الخلايا ذات حجر متعددة (24 حجرة لكل صحن ومساحة لحجرة تساوي 2 س) . وأضيف لكل حجرة في هذا الصحن مليليتر واحد من معلق الخلايا (مليوني خلية) وبعدها أضيفت الكمية المطلوبة من الكحول الأثيلي. ووضعت هذه الصحون في حاضنة على درجة حرارة 37 م وفي جو من 95% هواء و 5 % ثاني أكسيد الكربون وتمت المحافظة على حامضية الوسط الزراعي ما بين 7.3 - 7.4. ولأخذ عينات من هذه الخلايا لإجراء التحليلات المطلوبة عليها أخذت محتويات حجرات معينة بواسطة ماصة بعد فترات زمنية محدده وتم تجميدها، وعندما يراد تحليل هذه العينات تذاب وتعرض لأمواج صوتية لتكسيرها إما لأغراض قياس كمية اندماج الحامض النووي في البروتينات فقد أخذ ما يعادل أربعة مليمترات من معلق الخلايا ووضعت في

صحن بيتري قطلره 60 مليميتر. ثم أضيف الحامض الأميني المشع لوسين لهذه الخلايا بتركيز يعادل 10 ميكروكيوري لكل مليليتر وبعد ذلك أخذت عينات في أوقات معينة لتحليلها.

ء طرق التحليل،:

تم قياس فعالية ثلاثة من أنزيمات الليسوزومات في الوسط الذي زرعت فيه الخلايا بعد تكسيرها. تم قياس كل من الأنزيم الذي يكسر الحامض النووي الرايبوزي منقوص الأكسجين (DNAase) والأنزيم الذي يكسر الحامض النووي الرايبوزي (RNAase) وذلك بتعديل بسيط على الطريقة التي وصفها ديدوف ورفاقه وفاس وجاكوس (23، 24) وكل وحدة من هذين الأنزيمين تعمل على تكسير ميكرومود واحد من الحامض النووي الرايبوزي أو الحامض النووي الرايبوزي منقوص الأكسجين لمدة ساعة على درجة حرارة 37 م.

أما الأنزيم الذي يفصل جزئي الفوسفات في وسط حامض فقد تم قياسه بتعديل الطريقة التي وصافها نيل وهورنر. وكل وحدة من هذا الأنزيم تعمل على تحليل ميكرومول واحد من 3 - نيترات الفنيل الفوسفاتي في مدة نصف ساعة وفي درجة حرارة الغرفة. وأما كمية البروتين فقد تم تعيينها بواسطة طريقة لوري ورفاقه واستخدام زلال مصل الأبقار كمعيار. وتم قياس كمية اندماج الحامض الأميني كما ذكر في طريقة سابقة مدونة.

النتائج